تکنیک بلاتینگ (Blotting Technique) یا روش لکه‌ گذاری در زیست‌شناسی ‌مولکولی  روشی است که برای شناسایی اسیدهای نوکلئیک و پروتئین‌ها به کار می‌رود و به طور کلی جهت تشخیص اهداف بیولوژیکی  مورد استفاده قرار می‌گیرد. در ژنتیک مولکولی به انتقال مولکول‌های تفکیک شده در الکتروفورز از ژل به روی یک غشا ویژه، بلاتینگ یا بلات کردن گفته می‌شود. در تکنیک لکه گذاری مولکول مورد نظر را بر روی یک بستر که معمولا یک غشای نیتروسلولزی است، تثبیت می‌کنند.

 بر روی ژل نمی‌توان به خوبی هیبریداسیون اسیدهای نوکلئیک و شناسایی پروتئین‌ها را انجام داد. زیرا ژل‌ها نفوذپذیری کمی دارند و شناساگرها (Probe) به راحتی از ژل خارج می‌شوند. به همین دلیل برای هیبریداسیون و تفکیک مولکول‌ها از غشا استفاده می‌شود.

اصول تکنیک‌های بلاتینگ

تکنیک بلاتینگ ابزاری برای شناسایی مولکول‌های زیستی مانند DNA، RNA و پروتئین در مراحل مختلف بیان ژن است. انواع مولکول‌های اسیدهای نوکلئیک و پروتئین‌ها با استفاده از این تکنیک‌ها جداسازی می‌شوند. روش لکه ‌گذاری مخلوطی از مولکول‌های مورد نظر را با عبور از طریق ژل الکتروفورز، براساس اندازه مولکولی جدا می‌کند.

در مرحله بعد مولکول‌های تفکیک شده روی ژل با یک غشا به حالت پرس قرار می‌گیرند که در این حالت مولکول‌ها از ژل به داخل غشا (جنس غشا می‌تواند نیترو سلولز یا پلی وینیلیدن فلوراید و… باشد) از طریق اثر مویینگی انتقال می‌یابند. بعد از اینکه مولکول‌ها به غشا منتقل می‌شوند، موقعیت آن‌ها تغییر نمی‌کند. بر روی غشاها پروب‌های نشان‌دار اضافه می‌شوند که با مولکول‌های مورد نظر هیبرید می‌شوند. پس از هیبریداسیون و شستشوی مولکول‌های هیبرید نشده، غشا توسط پرتوهای آشکارساز X-ray  مشاهده می‌شود، در این حالت وجود مولکول‌ها قابل ردیابی است.

 انواع روش‌های بلاتینگ

تکنیک بلاتینگ براساس نوع مولکولی که جداسازی می‌کند به سه دسته کلی تقسیم می‌شوند:

• ساترن بلات (Southern blotting)
• نوترن بلات (Northern blotting)
• وسترن‌بلات (western blotting)

قطعات اسید نوکلئیک‌های تک رشته‌ای که توالی آن‌ها شناخته شده ‌است، شناساگر یا پروب نامیده می‌شوند و در هیبریداسیون بلاتینگ برای شناسایی مولکول‌های DNA و RNA مورد استفاده قرار می‌گیرند. برخی از پروب‌ها نیر از جنس پروتئین هستند که برای ردیابی اهداف پروتئینی به کار می‌روند از جمله این پروب‌ها می‌توان به آنتی بادی‌ها اشاره کرد. پروب‌ها می‌توانند رادیواکتیو باشند یا با مواد شیمیایی رنگی و یا موادی که منجر به تولید فلورسنت می‌شوند، برچسب دار شوند.

در هر یک تکنیک‌های بلاتینگ از پروب‌های اختصاصی استفاده می‌شود:

• پروب ساترن‌بلات: cDNA
• پروب نوترن بلات: cDNA
• پروب وسترن‌بلات:  آنتی‌بادی

ساترن ‌بلات

 Southern Blotting توسط دانشمند زیست شیمی اهل انگلستان به نام «ادوین ساوترن» (Edwin Southern) در سال ۱۹۷۵ معرفی شد. این تکنیک به عنوان یک روش برای تشخیص توالی‌های خاص  DNA در نمونه‌های زیستی مورد استفاده قرار می‌گیرد.  از این تکنیک می‌توان برای ردیابی یک ژن خاص در کل ژنوم استفاده کرد.

در  ساترن ‌بلات، قطعات DNA  باید برای انجام هیبریداسیون دناتوره (تک رشته ای) بشوند، بنابراین زمانی که قطعات DNA  تک رشته‌ای به غشا منتقل می‌شوند، می‌توانند با پروب هیبرید شوند DNA . تک‌رشته‌ای در غشا در معرض پروب‌های نشان‌دار ‌شده قرار می‌گیرد. اگر این پروب مکمل هر یک از قطعات DNA تک رشته‌ای باشد، هیبرید تشکیل می‌دهد و پروب در محل‌های قطعات مکمل به غشا متصل می‌شود. وجود هیبریداسیون‌ها با ردیابی پروب‌های نشان‌دار روی غشا قابل شناسایی است. غشاها توسط تکنیک X-ray مورد بررسی قرار می‌گیرند و به این ترتیب وجود هیبریدها قابل مشاهده است.

مراحل انجام ساترن بلات

همان طور که گفته شد، این روش برای تجزیه و تحلیل توالی‌های DNA استفاده می‌شود و مراحل زیر را شامل می‌شود:

• در مرحله اول، DNA با وزن زیاد با استفاده از آنزیم‌های اندونوکلئاز محدود کننده به قطعات کوچک شکسته می‌شوند.

• سپس این قطعات بر روی ژل جداکننده الکتروفورز قرار داده می‌شوند تا با توجه به اندازه آن‌ها از یکدیگر جدا شوند.

• اگر قطعات DNA از نظر اندازه بسیار بزرگ باشند (بزرگتر از ۱۵ کیلوباز)، در مرحله اول ژل را باید با هیدروکلراید تیمار کرد که این امر باعث می‌شود، قطعات DNA به قطعات کوچک‌تر تقسیم شوند و از این طریق امکان انتقال رشته‌های DNA به صورت دقیق‌تری از ژل به غشا فراهم می‌شود.

• بعد از جدا شدن قطعات DNA بر روی ژل، یک ورقه نیتروسلولوز به عنوان غشا روی ژل جداکننده قرار داده می‌شود و با اعمال فشار بر روی غشا و ژل تعامل مناسب بین این دو ایجاد می‌شود.

• پس از آن غشا در معرض اشعه ماوراء بنفش قرار می‌گیرد یا در خلا یا آون با دمای ۸۰ درجه سانتی‌گراد به مدت ۲ساعت حرارت داده می‌شود تا قطعات به طور دائم به غشا متصل شوند.

• سپس غشا در معرض پروب هیبریداسیون قرار می‌گیرد. در این زمان این مولکول با یک رنگ کروموژنیک برچسب زده می‌شود، پروب DNA به گونه‌ای برچسب گذاری می‌شود که می‌تواند به راحتی آن را تشخیص دهد.

• پس از فرآیند هیبریداسیون، پروب‌های اضافی با استفاده از بافر SSC از بین می‌روند و می‌توان آن را با استفاده از Autoradiography در فیلم اشعه ایکس مشاهده کرد و قطعاتی که با پروب‌های نشان‌دار هیبرید شده‌اند را مورد شناسایی قرار داد.

برنامه‌های کاربردی روش ساترن بلات

• برای شناسایی DNA در نمونه‌ها
• انگشت نگاری DNA (DNA finger printing)
• کاربرد در پزشکی قانونی، آزمایش تعیین والدین، شناسایی مجرم
• برای جداسازی و شناسایی ژن‌های مورد نظر در نمونه
• در پلی مورفیسم قطعه محدودکننده یا تکنیک RFLP
• برای شناسایی جهش یا تنظیمات ژن در توالی DNA
• در تشخیص بیماری ناشی از نقایص ژنتیکی
• برای شناسایی عوامل عفونی

نورترن ‌بلات

نورترن ‌بلات مشابه روش ساترن است با این تفاوت که مولکول‌های RNA به جای DNA روی ژل جداسازی شده و به غشای منتقل می‌شوند. نورترن اغلب برای شناسایی mRNA استفاده می‌شود. شدت نشانگر شناسایی شده در نورترن ‌بلات نشان‌دهنده میزان mRNA مربوط به ژن هدف است که از طریق آن میزان بیان ژن و رونویسی قابل تشخیص است. هیبریداسیونی که در این روش  صورت می‌گیرد، اغلب برای شناسایی ژن ها در فرایند کلون سازی استفاده می‌شود. این روش به ویژه زمانی کاربرد دارد که ژن کلون شده در میزبان بیان نمی‌شود یا روشی برای ردیابی محصول ژن وجود ندارد.

مراحل انجام نورترن بلات

روش لکه ‌گذاری شمالی توسط جیمز الوین و همکارانش در سال ۱۹۷۷ معرفی شد. این روش برای تجزیه و تحلیل و تشخیص RNA در یک نمونه مورد استفاده قرار می‌گیرد. مراحل انجام این تکنیک شامل موارد زیر است:

• در مرحله اول، mRNA را از سلول‌های مورد نظر جدا کرده و خالص می‌کنند.
• این RNA‌ها را روی ژل های آگاروز حاوی فرمالدئید به عنوان ماده منفی کننده RNA جداسازی می‌کنند.
• این ژل به مدت 5-10 دقیقه در بافر رقیق غوطه ور می‌شود و سپس با آب شسته می‌شود.
• پس از این مرحله، این قطعات RNA را بر روی کاغذ فیلتر آمینو بنزیلوکسی متیل (Aminobenzyloxymethyl) به غشای حامل منتقل می‌کنند.
• پس از انتقال RNA ، این مولکول‌ها با استفاده از اشعه ماوراء بنفش یا گرما روی غشا مورد نظر تثبیت می‌شوند.
• پروب نشان‌دار شده DNA را برای هیبریداسیون به غشا اضافه می‌کنند.
• پروب‌های اضافی و متصل نشده طی یک مرحله شستشو از بین می‌رود و در انتها ترکیبی از mRNA-DNA توسط فیلم اشعه ایکس تشخیص داده می‌شود.

برنامه های کاربردی نورترن بلات

• استفاده در مطالعات بیان ژن، برای مشاهده بیان بیش از حد ژن‌های ایجادکننده سرطان و بیان ژن در صورت رد پیوند
• برای تشخیص چندین بیماری، به عنوان مثال «بیماری کرون» (Crohn’s disease)
• برای تشخیص micRNA‌های ویروسی که نقش مهمی در عفونت ویروسی دارند.
• برای غربالگری نوترکیب‌ها با شناسایی mRNA تشکیل شده توسط ترانس ژن‌ها

وسترن ‌بلات

از روش وسترن بلات برای تشخیص و آنالیز پروتئین‌ها استفاده می‌شود. با کاربرد این تکنیک دانشمندان قادر خواهند بود پروتئین‌های خاصی از مخلوط پروتئین‌های استخراج شده از سلول‌ها را شناسایی کنند. پس از جداسازی پروتئین‌ها براساس سایز و وزن‌مولکولی روی ژل الکتروفورز، آن‌ها به غشا منتقل شده و توسط آنتی‌بادی‌های اختصاصی شناسایی می‌‌شوند. در مقایسه با تکنیک الایزا، وسترن‌بلات اختصاصیت بالاتری دارد در حالی که مانند روش الایزا دقت بالایی ندارد. در واقعا روش وسترن‌بلات به دلیل هزینه بالا، بیشتر به عنوان آزمون تاییدکننده روش الایزا مورد استفاده قرار می‌گیرد.

مراحل انجام وسترن بلات

روش وسترن بلات براساس نام ابداع کننده آن W. Neal Burnette نامگذاری شده است. این روش برای تشخیص، تجزیه و تحلیل پروتئین در یک نمونه معین استفاده می‌شود و مراحل زیر را شامل می‌شود:

• در اولین مرحله جداسازی پروتئین از نمونه‌های مورد نظر انجام می‌شود.
• پس از آن بتا-مرکاپتواتانول (BME) و سدیم دودسیل سولفات (SDS) به پروتئین اضافه می‌شود.
• سپس، پروتئین متصل به SDS در چاهک‌های ژل الکتروفورز قرار می‌گیرد. به منظور تعیین وزن مولکولی سایر پروتئین‌ها، یک نشانگر وزن مولکولی نیز در یکی از چاهک‌ها بارگذاری می‌شود. پس از آن سایر نمونه‌ها در چاهک‌های باقیمانده قرار می‌گیرند.
• پس از بارگیری نمونه‌ها و نشانگرها، جریان در ژل برقرار می‌شود. پروتئین به قطب مثبت چاهک یعنی به سمت پایین کشیده می‌شود، زیرا پروتئین با پیوندی محکم به SDS متصل است که بار منفی دارد. حرکت پروتئین با اندازه آن رابطه معکوس دارد.
• بعد از این مرحله ، ژل در برابر غشایی قرار می‌گیرد و با قطع جریان در ژل، تمام پروتئین‌ها به غشا منتقل می‌شوند.
• در این مرحله روش ایمونوبلاتینگ (Immunoblotting) باید انجام شود. غشاهای مورد استفاده در این روش معمولا ظرفیت زیادی برای اتصال به پروتئین‌ها دارند، به همین دلیل ممکن است با اتصال پروتئین‌ها به مواد نشان‌دار مانند آنتی بادی‌ها، در روند تشخیص اختلال ایجاد شود. در این روش ابتدا غشا را با پروتئین غیراختصاصی مسدود می‌کنند تا از اتصال آنتی بادی به غشایی که پروتئین‌های مورد نظر در آن وجود ندارد، جلوگیری شود.
• پس از آن آنتی بادی اولیه به محلول اضافه می‌شود. این آنتی بادی‌ها مسئول شناسایی یک دنباله آمینه اسید خاص هستند. پس از این مرحله یک مرحله شستشو وجود دارد تا آنتی بادی اولیه اضافه از سطح واکنش خارج شود و آنتی بادی ثانویه اضافه شود.
• اکنون این آنتی بادی‌ها با آنزیم کونژوگه می‌شوند و آنتی بادی اولیه را شناسایی می‌کنند. سرانجام، مرحله شستشوی دیگری برای از بین بردن آنتی بادی ثانویه اضافی انجام می‌شود.
• در این مرحله با استفاده از روش کمولومینسانس (chemiluminescence) برای تشخیص استفاده می‌شود. به محض افزودن سوبسترا، نور از آن ساطع می‌شود (واکنش بین آنزیم و سوبسترا انجام می‌شود) و با تصویربرداری با دستگاه‌های آشکار ساز این نور قابل ردیابی است.

برنامه‌های کاربردی وسترن بلات

• تشخیص حالت فسفریلاسیون پروتئین
• تشخیص تغییرات میزان پروتئین در طول درمان‌های دارویی
• تشخیص تغییرات سطح پروتئین در فازهای زمانی
• شناسایی ایزوفرم‌های کوتاه شده پروتئین‌ها
• شناسایی پروتئین‌های برچسب خورده یا نشان‌دار

روش ایسترن بلات

ایسترن بلات یا بلات شرقی، یک روش بیوشیمیایی است که برای تجزیه و تحلیل تغییرات پروتئین پس از ترجمه (Post-Translational Modification) یا (PTM) از جمله افزودن لیپیدها، فسفات‌ها و کربوهیدرات‌ها استفاده می‌شود. از لکه ‌گذاری شرقی اغلب در تشخیص اپی‌توپ‌های کربوهیدرات استفاده می‌شود. بنابراین این تکنیک را می‌توان نوعی از تکنیک بیوشیمیایی وسترن بلات دانست. روش‌های متعددی تحت عنوان لکه‌گذار شرقی توصیف شده‌اند که اکثر آن‌ها اهداف پروتئینی دارند که آن‌ها را از ژل SDS-PAGE بر روی یک غشای پلی‌ وینیلیدین PVDF یا نیتروسلولوز منتقل می‌کنند. پروتئین‌های انتقال یافته برای اصلاحات پس از ترجمه با استفاده از پروب‌هایی که ممکن است تغییراتی مانند اتصال به لیپیدها، کربوهیدرات‌ها، فسفوریلاسیون یا هر نوع اصلاح پروتئین دیگر را تشخیص دهند، مورد تجزیه و تحلیل قرار می‌گیرند.

مراحل انجام ایسترن بلاتینگ

لکه‌ گذاری شرقی توسط بوگدانف توسعه داده شده است. این روش برای شناسایی اپی توپ‌های کربوهیدرات از جمله گلیکوکونژوژات ها و لیپیدها استفاده می‌شود. پروتئین‌هایی که با این روش قرار است مورد تشخیص قرار گیرند، پس از انتقال به غشای مورد استفاده، با به کارگیری از یک پروب برای شناسایی اصلاحات پس از ترجمه مورد تجزیه و تحلیل قرار می‌گیرند و از این رو کربوهیدرات‌ها و لیپیدها را شناسایی می‌کنند. مراحل ایسترن بلات شامل موارد زیر می‌شود:

• در مرحله اول، با استفاده از ژل الکتروفورز، مولکول‌های هدف به صورت عمودی از هم جدا می‌شود.

• سپس، این مولکول‌های جدا شده به صورت افقی بر روی غشای نیتروسلولوز انتقال می‌یابند.
• پس از آن آنتی بادی اولیه به محلول اضافه می‌شود. این آنتی بادی‌ها مسئول شناسایی یک دنباله آمینه اسید خاص هستند. بعد از آن با یک مرحله شستشو آنتی بادی‌های اتصال نیافته از بین می‌روند و آنتی بادی ثانویه نشان‌دار شده به محیط اضافه به می‌شود.
• در مرحله آخر مانند سایر روش‌های بلاتینگ از تکنیک‌های تصویربرداری با  UV یا اشعه ایکس مولکول‌های مورد نظر شناسایی می‌شوند.

برنامه‌های کاربردی ایسترن بلاتینگ

• برای شناسایی تغییرات پس از ترجمه پروتئین‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد.
• برای مطالعات اتصال با استفاده از لیگاندهای مختلف استفاده می‌شود.
• برای خالص‌سازی فسفولیپیدهای مختلف به کار می‌رود.

مقایسه روش‌های مختلف بلاتینگ

اساس انجام روش‌های نورترن ‌بلات، ساترن ‌بلات و وسترن بلات مشابه هم انجام می‌شوند، با این حال تفاوت‌هایی بین این تکنیک‌ها وجود دارد که از جمله این تفاوت‌ها می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:

 در ساترن‌ بلاتDNA ، در نورترن ‌بلات RNA و در وسترن پروتئین‌ها از یکدیگر تفکیک می‌شود. به دلیل تک رشته بودن RNA در نورترن ‌بلات مرحله دناتوراسیون حذف می‌شود. در حالی که این مرحله در ساترن ‌بلات ضروری است. نوع غشای مورد استفاده در این روش‌ها نیز می‌تواند متفاوت باشد، در ساترن ‌بلات از غشای نیتروسلولوز، در نورترن‌بلات از کاغذ آمینوبنزویل‌اکسی‌متیل و در وسترن از نیتروسلولز یا پلی‌ وینیلیدن ‌فلوراید استفاده می‌شود. در ساترن ‌بلات هیبرید DNA – DNA و در نورترن ‌بلات هیبرید  DNA – RNA و در وسترن بلات هیبرید پروتئین – آنتی‌بادی ایجاد می‌شود.

جمع‌بندی

از تکنیک بلاتینگ  برای اهداف مختلفی مانند تشخیص انواع ماکرومولکول‌ها استفاده می‌شود. از روش ساترن بلات برای تجزیه و تحلیل DNA، از وسترن بلات برای آنالیز پروتئین، از نورترن بلاتینگ به منظور آنالیز RNA و از روش ایسترن برای تشخیص تغییرات پس از ترجمه پروتئین‌ها استفاده می‌شود.