کلونینگ ژن یا شبیه سازی DNA یک روش زیست شناسی مولکولی است که بسیاری از نسخه های مشابه یک قطعه DNA، مانند یک ژن را تولید می‌‌کند.

در یک آزمایش شبیه سازی معمول، یک ژن هدف در یک قطعه حلقوی DNA به نام پلاسمید قرار می‌گیرد.

پلاسمید از طریق فرایندی به نام ترانسفورماسیون به باکتری وارد شده و باکتری‌های حامل پلاسمید با استفاده از آنتی بیوتیک انتخاب می‌شوند. از باکتری‌هایی که پلاسمید مورد نظر را دریافت کرده‌اند، برای تولید DNA پلاسمید بیشتر یا در برخی موارد برای بیان ژن و ساخت پروتئین استفاده می‌شود.

کلونینگ ژن چیست؟

هنگامی‌که کلمه کلونینگ را می‌شنوید، ممکن است به کلونینگ کامل یک موجود زنده مانند گوسفند دالی (Dolly) فکر کنید. اما مفهوم کلی کلونینگ، ایجاد کپی‌های دقیق از یک ژن است. در آزمایشگاه‌های زیست شناسی مولکولی، اغلب یک ژن یا یک قطعه کوچک از DNA را کلون می‌کنند.

زمانی که یک زیست شناس مولکولی می‌گوید که کلونینگ او کار نمی‌کند، او قطعا در مورد کپی کردن قطعات DNA صحبت می‌کند، نه تولید گوسفند دالی بعدی!

کلونینگ ژن فرایند ایجاد چندین نسخه‌ی یکسان از یک قطعه خاص از DNA است. زمانی که هدف ما افزایش نسخه‌های یک ژن و یا تولید انبوه یک پروتئین خاص (پروتئین‌های مهم در پزشکی) باشد از تکنیک کلونینگ استفاده می‌کنیم. قرار دادن ژن مورد نظر با استفاده از آنزیم‌هایی انجام می‌شود که DNA را برش می‌زنند و سپس به یکدیگر متصل می‌کنند و یک مولکول DNA نوترکیب یا DNA مونتاژ شده از قطعات ژنی از منابع مختلف تولید می‌کنند. شبیه سازی DNA فرآیند ساخت کپی‌های متعدد و یکسان از قطعه خاصی از DNA است.

در مرحله بعد، پلاسمید نوترکیب به باکتری‌ها وارد می‌شود. باکتری‌های حامل پلاسمید شناسایی شده و از سایر باکتری‌ها جدا می‌شوند و در محیط مناسب رشد قرار می‌گیرند. هنگام تولید مثل و تکثیر باکتری‌ها، آن‌ها پلاسمید را تکثیر کرده و به فرزندان خود منتقل می‌کنند و نسخه‌هایی از DNA موجود در آن را تهیه می‌کنند.

ساخت نسخه‌های زیادی از توالی DNA در یک پلاسمید چه فایده ای دارد؟ در بعضی موارد، برای انجام آزمایش‌ها یا ساختن پلاسمیدهای جدید، به نسخه‌های DNA زیادی نیاز داریم. در موارد دیگر، قطعه DNA یک پروتئین مفید را رمزگذاری می‌کند و از باکتری‌ها به عنوان کارخانه‌ای برای تولید پروتئین استفاده می‌شود. در واقع با کلونینگ می‌توان کارخانه تولید پروتئین ایجاد کرد. در طی فرایند شبیه‌سازی ژن قطعه‌ای ازDNA  (ژن مورد نظر) خارجی درون DNA‌های حلقوی به عنوان ناقل یا وکتور(vector) وارد سلول میزبان(اکثرا باکتری هستند) می‌شود و امکانات سلول میزبان را برای تولید ژن و سنتز پروتئین به خدمت می‌گیرد.

به عنوان مثال، ژن انسولین انسانی در باکتری E. coli بیان می‌شود و انسولین مورد استفاده در بیماران دیابتی را تولید می‌کند.

مراحل انجام کلونینگ ژن

مراحل انجام کلونینگ را می‌توان به صورت خلاصه این گونه بیان کرد:

۱-جداسازی قطعه ژنی مورد نظر از ژنوم

در کلونینگ، ژن از یک سلول یا ارگانیسم (دهنده) به یک باکتری (گیرنده) وارد می‌شود. برای این کار ابتدا ژنوم سلول دهنده به طور کامل استخراج می‌شود و سپس توسط آنزیم‌هایی به نام آنزیم‌های محدودکننده به قطعاتی با طول‌های متفاوت برش داده می‌شود. از بین این قطعات ژن مورد نظر قابل جداسازی است.

۲-انتخاب وکتور مناسب

وکتورها که اغلب به عنوان پلاسمید‌هایی (plasmid) با DNA حلقوی شناخته می‌شوند که عموما دارای ژن مقاومت به آنتی بیوتیک هستند. از این ژن‌های مقاومت در مراحل بعد برای شناسایی پلاسمیدهای نوترکیب (recombinant plasmid) استفاده می‌شود. انواع دیگری از وکتورها نیز هستند که در کنار پلاسمیدها برای کلونینگ استفاده می‌شوند:

• باکتریوفاژها (bacteriophage): باکتریوفاژها ویروس‌هایی هستند که قابلیت مناسبی برای ورود به باکتری دارند. نفوذپذیری بالای این وکتورها باعث پایداری زیاد بیان ژن در سلول میزبان می‌شود.
• کازمیدها (cosmid): کازمیدها نوعی پلاسمیدهای هیبریدی به شمار می‌آیند که شامل توالی cos باکتریوفاژ لاندا همراه با توالی پلاسمید هستند.

.( cos sites + plasmid = cosmids)

۳-ادغام ژن مورد نظر با پلاسمید (ایجاد پلاسمید نوترکیب)

چگونه می‌توان قطعات DNA از منابع مختلف را به هم پیوند داد؟ در یک روش معمول از دو نوع آنزیم استفاده می‌شود: آنزیم های محدود کننده و DNA لیگاز.

آنزیم محدود کننده نوعی آنزیم برش دهنده DNA است که توالی هدف خاصی را تشخیص می‌دهد و DNA را در نزدیکی آن محل به دو قسمت تقسیم می‌کند. بسیاری از آنزیم‌های محدود کنندهدر محل برش خود انتهاهایی با اورهنگ‌هایی با انتهای کوتاه و تک رشته‌ای تولید می‌کنند. اگر دو مولکول دارای انتهای مکمل باشند، بازهای آن‌ها می‌توانند با یکدیگر جفت شده و بهم متصل شوند. با این حال، تا زمانی که توسط DNA لیگاز که شکاف‌های موجود در رشته‌های DNA را به هم می‌چسباند وارد عمل نشود، رشته‌های DNA فقط در کنار هم قرار می‌گیرند اما به یکدیگر متصل نمی‌شوند.

هدف ما از شبیه سازی قرار دادن یک ژن هدف (به عنوان مثال برای انسولین انسانی) در یک پلاسمید است. با استفاده از یک آنزیم محدود کننده که با دقت انتخاب شده است می‌توان مراحل زیر را انجام داد و برش‌هایی را ایجاد کرد:

• برش پلاسمید با آنزیم محدود کننده که دارای یک محل برش واحد است.
• برش و جداسازی قطعه ژن هدف با آنزیم محدود کننده که نزدیک هر انتها دارای یک محل برش است.

سپس، ما قطعات را با DNA لیگاز ترکیب می‌کنیم که آن‌ها را بهم پیوند می‌دهد و یک پلاسمید نوترکیب حاوی ژن ایجاد می‌کند.

۴- انتقال پلاسمید به میزبان

از مهم‌ترین روش‌های انتقال پلاسمید به میزبان ترانسفورماسیون است. در این روش انتقال افقی ژن‌ها صورت می‌گیرد. در این تکنیک در شرایط مشخص (شوک حرارتی، شرایط یونی و..) سلول‌های میزبان و وکتورها را در کنار هم قرار می‌دهند تا انتقال صورت گیرد.

از دیگر روش های معمول انتقال وکتور به میزبان می‌توان از روش الکتروپوریشن (Electroporation) و تفنگ ژنی (Gene Gun) نام برد. الکتروپوریشن تکنیکی است که در آن با قرار دادن سلول‌ها در محیط دارای بار الکتریکی، باعث ایجاد منافذی در غشای سلول‌ها می‌شوند. در این حالت وکتورها قادرند به باکتری‌ها وارد شوند.

تفنگ ژنی نیز وسیله‌ای است که با شلیک گلوله‌های حاوی DNA، آن‌ها را به سلول میزبان وارد می‌کند در این تکنیک انتقال از روش مکانیکی انجام می‌گیرد.

روش‌های متفاوت دیگری برای انجام انتقال ژن قابل انجام است که از جمله آن‌ها می‌توان به روش‌هایی مانند ترانسفورماسیون با استفاده از لیپوزوم، ترانسفورماسیون با استفاده از فیبر سیلیکون کرباید، ترانسفورماسیون با استفاده از اولتراسوند، روش‌های انتقال شیمیایی و رسوب با کلسیم و… اشاره کرد.

۵- انتخاب و جداسازی سلول های حاوی وکتور

پلاسمید به طور معمول دارای ژن مقاومت آنتی بیوتیکی است که اجازه می‌دهد، باکتری‌ها در حضور یک آنتی بیوتیک خاص زنده بمانند. بنابراین، باکتری‌هایی که پلاسمید را دریافت کرده‌اند می‌توانند روی محیط کشت حاوی آنتی بیوتیک زنده بمانند.

در این محیط باکتری‌های فاقد پلاسمید می‌میرند، در حالی که باکتری‌های حامل یک پلاسمید می‌توانند زنده بمانند و تولید مثل کنند. هر باکتری زنده مانده یک گروه کوچک نقطه مانند یا کلنی ایجاد می‌کند. این کلنی‌ها از باکتری های یکسان که همگی پلاسمید یکسانی را حمل می‌کنند، تشکیل شده است.

همه کلنی‌ها لزوماً حاوی پلاسمید مناسب نخواهند بود. این امر به این دلیل است که در حین اتصال یا لایگیشن، قطعات DNA همیشه دقیقاً به همان طریقی که ند نظر ما است به یکدیگر متصل نمی‌شوند. در عوض، ما باید DNA را از چندین کلنی جمع آوری کنیم و ببینیم که کدام یک حاوی پلاسمید مناسب هستند. روش‌هایی مانند برش با آنزیم محدود کننده و PCR معمولاً برای بررسی پلاسمیدها مورد استفاده قرار می‌گیرند.

۶- تکثیر (Replication) و انتقال پلاسمید حاوی ژن از سلول مادر به سلول‌های دختری

در این مرحله سلول‌های دارای وکتور را کشت می‌دهند. همراه با همانندسازی ژنوم سلول‌ها، ژنوم پلاسمید هم تکثیر شده و به سلول‌های دختری نسل جدید منتقل می‌شود.

۷- رونویسی(Transcription) و سنتز پروتئین

پلاسمیدها می‌توانند از امکانات سلول میزبان استفاده کرده و از ژن‌های خود رونویسی کنند. mRNAهای تولیدی از پلاسمیدها درون سلول میزبان به پروتئین‌های مورد نظر ترجمه (translation) و سنتز می‌شوند. بنابراین کلونی‌های متعددی از سلول‌ها ایجاد می­شوند که دارای ژن مورد نظر هستند در این حالت به اصطلاح ژن کلون شده است.

هنگامی‌ که پروتئین هدف تولید می‌شود، باید آن‌ را از سلول‌های باکتریایی استخراج کرد و از طریق تکنیک‌های بیوشیمیایی از سایر پروتئین‌های باکتری جدا نمود. پروتئین خالص‌شده برای مصارف درمانی و تحقیقاتی مورد استفاده قرار می‌گیرد.

تولید پروتئین

هنگامی‌که ما یک کلنی باکتریایی با پلاسمید مناسب پیدا کردیم، می‌توانیم یک محیط کشت بزرگ از باکتری‌های حامل پلاسمید را رشد دهیم. سپس، ما یک سیگنال شیمیایی به باکتری‌ها می‌دهیم که به آن‌ها دستور می‌دهد پروتئین مورد نظر را بسازند.

این باکتری ها به عنوان کارخانه‌های کوچک عمل می‌کنند و مقدار زیادی پروتئین را از بین می‌برند. به عنوان مثال، اگر پلاسمید ما حاوی ژن انسولین انسانی باشد، باکتری‌ها شروع به رونویسی ژن و ترجمه mRNA انسولین می‌کنند تا مولکول‌های زیادی از پروتئین انسولین انسانی تولید کنند.

پس از تولید پروتئین می‌توان سلول‌های باکتری را با تکنیک‌هایی لیز کرده و پروتئین‌های آن‌ها را آزاد کرد. بسیاری از پروتئین‌ها و ماکرومولکول‌های دیگر وجود دارند که علاوه بر پروتئین هدف (مانند انسولین) در باکتری ها شناور هستند. به همین دلیل، پروتئین هدف باید خالص شده یا با استفاده از روش‌های بیوشیمیایی از سایر محتویات سلول جدا شود. پروتئین خالص شده را می‌توان برای برنامه‌های تحقیقاتی یا در مورد انسولین برای بیماران استفاده کرد.

کاربردهای شبیه سازی DNA

مولکول‌های DNA و پروتئین‌های ساخته شده از طریق تکنیک‌های کلونینگ برای بسیاری از اهداف در زیست شناسی مولکولی استفاده می‌شود. یک لیست کوتاه از انواع کاربردهای کلونینگ شامل موارد زیر است:

• بیوداروها (Biopharmaceuticals): کلونینگ DNA می‌تواند برای تولید پروتئین‌های انسانی با کاربردهای پزشکی مانند انسولین استفاده شود. نمونه‌های دیگری از پروتئین‌های نوترکیب شامل هورمون رشد انسان است که به بیمارانی که قادر به سنتز این هورمون نیستند، تجویز می‌شود و یا  فعال کننده بافت پلاسمینوژن (tPA) که برای درمان سکته مغزی و جلوگیری از لخته شدن خون استفاده می‌شود. پروتئین‌های نوترکیب مانند پروتئین‌های دارویی اغلب در باکتری‌ها ساخته می‌شوند.

ژن درمانی:  در برخی از اختلالات ژنتیکی، بیماران فاقد فرم نرمال عملکرد یک ژن خاص هستند. تکنیک ژن درمانی تلاش می‌کند تا یک کپی طبیعی ژن را به سلول‌های بدن بیمار انتقال دهد. به عنوان مثال، در مطالعه‌ای کلونینگ برای ساخت پلاسمید‌های حاوی یک نسخه طبیعی از ژن دخیل در فیبروز کیستیک انجام شده‌است که در بیماران فیبروز کیستیک غیرفعال است. هنگامی ‌که  این پلاسمید‌ها به ریه‌های بیمار مبتلا به فیبروز کیستی منتقل می‌شود، افت عملکرد ریه کمتر می‌شود.

آنالیز ژن: در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی، زیست شناسان اغلب از کلونینگ DNA برای ساخت نسخه‌های مصنوعی و نوترکیب ژن ها استفاده می‌کنند که به آن‌ها کمک می‌کند تا بدانند چگونه ژن‌های نرمال در یک سیستم زنده فعال هستند.

موارد فوق تنها چند نمونه از چگونگی کلونینگ  و کاربرد آن در زیست شناسی امروز است. کلونینگ DNA تکنیک متداولی برای انواع مختلفی از برنامه های کاربردی زیست شناسی مولکولی به شمار می‌آید.

منبع: khanacademy