تست الایزا | انواع و کاربردهای آن

تست الایزا | انواع و کاربردهای آن

آزمون الایزا (ELISA (Enzyme Linked Immuno sorbent Assay برهم‌کنش بین آنتی ژن و آنتی بادی را مورد بررسی قرار می‌دهد.  این تکنیک در سال ۱۹۷۱، توسط پیتر پرلمن و اوا انگوال در دانشگاه استکهلم سوئد معرفی شد. الایزا یک روش بیوشیمیایی رایج است که معمولا برای اندازه‌گیری غلظت آنتی ‌بادی‌ها یا آنتی ‌ژن‌ها در خون استفاده می‌شود. این تکنیک بر روی یک صفحه (Plate) انجام می‌گیرد که برای تشخیص و اندازه‌گیری موادی مانند پپتیدها، پروتئین‌ها، آنتی ‌بادی‌ها و هورمون‌ها استفاده می‌شود. در این تکنیک یک آنزیم به آنتی ‌بادی به منظور تولید یک محصول رنگی، متصل می‌شود؛ چنین بستری، بستر کروموژنیک (Chromogenic) نامیده می‌شود.

پلیت‌ ۹۶ خانه الایزا
تصویر ۱: پلیت‌های ۹۶ خانه‌ای الایزا

 آنزیم‌هایی که معمولا در واکنش‌های الایزا مورد استفاده قرار می‌گیرند، شامل آلکالین فسفاتاز، اسید رادیک پراکسیداز و بتا‌گالاکتوزیداز هستند. ترکیبات مختلفی به عنوان سوبسترا برای این روش به کار گرفته می‌شوند که از جمله این ترکیبات می‌توان به مواردی چون اوره فنیلدیامین دی هیدروکلراید (برای پراکسیداز)، پارانیتروفنیل فسفات (برای آلکالین فسفاتاز) اشاره کرد که توسط آنزیم‌های نام برده هیدرولیز می‌شوند تا محصول نهایی و رنگ تولید شود.

اصول ELISA

آزمون ELISA معمولا در بستری از Plateهای ۹۶ خانه از جنس پلی‌استایرن انجام می‌شود. سرم‌ها در چاهک‌های Plate انکوبه (Incubation) شده و هر چاهک (Well) حاوی سرم متفاوتی است. یک سرم به عنوان کنترل مثبت و یک سرم تحت عنوان کنترل منفی در آزمون الایزا تعیین می‌شوند. روی سطح Plate  در هر چاهک آنتی ‌بادی به آنتی ‌ژن مورد نظر متصل می‌شود، آنتی بادی‌ها یا آنتی ‌ژن‌های موجود در سرم به آنتی ژن یا آنتی بادی مشابه موجود روی سطح اتصال می‌یابند. بعد از مدتی، این Plate برای حذف آنتی ‌بادی‌ها یا آنتی ‌ژن‌های اتصال‌نیافته با یک سری بافر شستشو، شسته می‌شود.

 برای شناسایی آنتی ‌بادی‌ها یا آنتی ژن‌های متصل شده، آنتی ‌بادی‌های ثانویه‌ای که به یک آنزیم متصل هستند یا به عبارتی دیگر توسط یک آنزیم نشان دار شده‌اند، مانند پراکسیداز یا آلکالین فسفاتاز به هر چاهک اضافه می‌شوند. پس از یک دوره انکوباسیون، آنتی ‌بادی‌های ثانویه که متصل نشده‌اند، با شستشو از بین می‌روند. هنگامی‌ که یک سوبسترا (Substrate) مناسب به محیط اضافه می‌شود، آنزیم با آن واکنش می‌دهد تا یک محصول رنگی و قابل ردیابی تولید کند. این رنگ تولید شده به عنوان یک تابع از مقدار آنتی ‌ژن یا آنتی ‌بادی موجود در نمونه قابل اندازه‌گیری است. شدت تراکم رنگی / نوری در طول موجی مشخص اندازه‌گیری می‌شود. شدت رنگ، نشان دهنده میزان آنتی ژن یا آنتی بادی است.

آزمون الایزا می‌تواند کاملاً پیچیده باشد و از چندین مرحله اضافه کردن آنتی‌ بادی‌ها و آنزیم‌ها در آن استفاده شود، به ویژه هنگام اندازه‌گیری غلظت پروتئین در نمونه‌‌های ناهمگن مانند خون مراحل مختلفی برای انجام آزمون الایزا مورد انجام قرار می‌گیرد. پیچیده‌ترین و متفاوت‌ترین مرحله در روند کلی آزمون، مرحله تشخیص است که در آن می‌توان از چندین لایه آنتی بادی برای تقویت سیگنال استفاده کرد.

انواع  ELISA

الایزا را می‌توان با تعدادی تغییر در اصول روش اصلی انجام داد، این تغییرات منجر به ایجاد ۴ روش مختلف از آزمون الایزا می‌شوند، این روش‌ها شامل موارد زیر هستند:

  • الایزا به روش مستقیم
  • الایزا به روش غیرمستقیم
  • الایزا ساندویچ
  • الایزا رقابتی یا مهاری

 مرحله کلیدی در تمام انواع الایزا، تثبیت آنتی ژن مورد نظر است که می‌تواند با جذب مستقیم به پلیت الایزا یا به طور غیرمستقیم از طریق یک آنتی بادی که به پلیت الایزا متصل شده است، انجام شود. سپس آنتی ژن به روش مستقیم با آنتی بادی اولیه نشان‌دار شده با آنزیم یا به طور غیرمستقیم با آنتی بادی ثانویه نشان‌دار شده با آنزیم مورد شناسایی قرار می‌گیرد. آنتی بادی‌‌های شناسایی کننده معمولاً با آنزیم‌های فسفاتاز قلیایی (AP) یا آنزیم پراکسیداز ترب کوهی (HRP) برچسب گذاری می‌شوند. انتخاب زیادی از سوبستراها برای انجام ELISA با استفاده از یکی از آنزیم‌های فسفاتاز قلیایی یا پراکسیداز ترب کوهی وجود دارند. انتخاب سوبسترا به میزان حساسیت سنجش مورد نظر و ابزار دقیق موجود برای تشخیص سیگنال‌های آزمون (اسپکتروفتومتر، فلورومتر یا نور سنج) بستگی دارد.

انواع الایزا
تصویر ۲: انواع روش‌های الایزا

در میان قالب‌های استاندارد سنجش الایزا مورد بحث در زیر و نشان داده شده در شکل، اختلاف بین آن‌ها در نوع اتصال و تشخیص آنتی‌ ژن است. استراتژی‌ مورد استفاده در هر یک از این روش‌ها، برای مرحله تشخیص، اختصاصی است. با این حال، به طور کلی در هر آزمون الایزا یک آنتی ژن به صفحه متصل می‌شود (با جذب مستقیم به سطح یا از طریق آنتی بادی از قبل کوت شده روی پلیت، مانند روش ساندویچ الایزا)، این مرحله تشخیص (به عنوان تشخیص مستقیم یا غیرمستقیم) است که تا حد زیادی تعیین کننده حساسیت یک آزمون الایزا است.

الایزا مستقیم (Direct ELISA)

روش الایزا مستقیم در ابتدا توسط پرلمن و انگوال توسعه داده شد. سطح پلیت در این روش به طور مستقیم با آنتی ژن پوشش داده می‌شود. آنتی‌ بادی نشان‌دار شده با آنزیم می‌تواند مقدار آنتی ‌ژن را اندازه‌گیری کند. پس از انکوباسیون، به وسیله شستشو، آنتی ‌بادی‌های آزاد و متصل نشده از محیط خارج می‌شوند. سپس سوبسترا مناسب آنزیم به محیط اضافه شده و یک سیگنال رنگی تولید می‌شود که به طور مستقیم با مقدار آنتی ‌ژن در نمونه در ارتباط است. از این همبستگی می‌توان برای تعیین غلظت آنتی ‌ژن در یک نمونه ناشناخته با یک منحنی استاندارد استفاده کرد. الایزا به روش مستقیم برای تعیین مقدار آنتی ‌ژن‌هایی با وزن مولکولی بالا مناسب است. الایزا مستقیم به عنوان ساده‌ترین نوع آزمون الایزا به شمار می‌آید.  این روش مراحل کمتری دارد و به طور قابل توجهی سریع‌تر از سایر انواع روش‌های الایزا انجام می‌گیرد. آنتی بادی ثانویه در این روش وجود ندارد با این حال، به ندرت از روش الایزا مستقیم استفاده می‌شود، زیرا کانژوگاسیون (conjugation) یا نشان‌دار کردن آنزیم با آنتی ‌بادی‌های اولیه، فرایندی زمان‌بر و گران قیمت است و از سویی دیگر، این فرایند ممکن است، برهمکنش آنتی ‌بادی و آنتی‌ ژن هدف را تحت تاثیر قرار دهد.

تصویر ۳: نحوه انجام الایزا به روش مستقیم

مزایای روش الایزای مستقیم

  • این روش از سرعت بالایی برخوردار است، زیرا فقط از یک آنتی بادی و مراحل کمتری برای انجام آزمون استفاده می‌شود.
  • واکنش متقاطع آنتی بادی ثانویه در این آزمون وجود ندارد.

معایب روش الایزای مستقیم

  • واکنش ایمنی آنتی بادی اولیه ممکن است با نشان‌دار کردن با آنزیم‌ها یا سایر واکنشگرها تحت تأثیر منفی قرار بگیرد.
  • نشان‌دار کردن آنتی بادی‌های اولیه برای هر آزمون الایزا بسیار وقت‌گیر و گران است.
  • عدم انعطاف پذیری در انتخاب نشان‌دار کردن آنتی بادی اولیه از آزمایشی به آزمایش دیگر، از معایب این آزمون به شمار می‌آید.
  • امکان تقویت سیگنال در این روش بسیار کم است.

الایزا غیرمستقیم (Indirect ELISA)

با الایزا غیرمستقیم تشخیص آنتی ‌بادی به صورت کمی ‌و کیفی قابل انجام است. در این روش ابتدا، آنتی ژن را بر روی سطح چاهک‌ها کوت می‌کنند. سرم و یا نمونه‌های دیگر حاوی آنتی ‌بادی اولیه به چاهک­‌ها اضافه شده و اجازه می‌دهند با آنتی ژن پوشش داده شده بر سطح، برهمکنش دهد. سپس هر یک از آنتی ‌بادی‌های متصل نشده با شستشو از بین می‌روند و آنتی ‌بادی متصل شده به آنتی ‌ژن، با افزودن آنتی‌ بادی ثانویه نشان‌دار شده با آنزیم، تشخیص داده می‌شود. بعد از شستشوی آنتی ‌بادی‌های ثانویه اتصال نیافته، سوبسترای مخصوص آنزیم به محیط آزمون اضافه می‌شود. آنزیم، سوبسترا را برای تشکیل محصولات رنگی هیدرولیز می‌کند. مقدار محصول نهایی رنگی توسط دستگاه «ELISA reader» مورد خوانش و اندازه‌گیری قرار می‌گیرد. دستگاه خوانش الایزا می‌تواند جذب تمام چاهک‌های صفحه ۹۶ عددی را اندازه‌گیری کند.

الایزا غیر مستقیم
تصویر ۴: مراحل تست الایزا غیرمستقیم و شناسایی آنتی بادی

این روش معمولا برای تشخیص عفونت توسط باکتری، ویروس یا انگل و اندازه‌گیری آنتی ‌بادی‌ها علیه آنتی ژن خارجی استفاده می‌شود. روش الایزا غیرمستقیم چند منظوره است، زیرا آنتی بادی‌ها با ساختارهای متفاوت می‌توانند به عنوان آنتی بادی اولیه مورد استفاده قرار گیرد. از آنجایی که بیش از یک آنتی بادی نشان‌دار ‌شده می‌تواند در واکنش تثبیت شود، الایزا غیر‌مستقیم روشی بسیار حساس‌تر و انعطاف پذیرتر از الایزا مستقیم محسوب می‌شود. با این حال، ممکن است آنتی بادی ثانویه واکنش متقابل و یا سیگنال غیراختصاصی در طول واکنش ایجاد کند.

مزایای روش الایزای غیرمستقیم

  • طیف گسترده‌ای از آنتی بادی‌های ثانویه نشان‌دار شده با آنزیم، به صورت تجاری در دسترس هستند.
  • این روش می‌تواند برای گستره متنوعی از آنتی بادی‌ها مورد استفاده قرار گیرد، زیرا بسیاری از آنتی بادی‌های اولیه که در یک گونه ساخته می‌شوند را می‌توان با استفاده از آنتی بادی ثانویه با نشان یا آنزیم مشابه مورد شناسایی قرار داد.
  • در این روش حداکثر واکنش ایمنی آنتی بادی اولیه حفظ می‌شود، زیرا نشان دار نمی‌شود.
  • در این روش حساسیت افزایش می‌یابد، زیرا هر آنتی بادی اولیه شامل چندین اپی توپ است که می‌توانند به آنتی بادی ثانویه نشان‌دار شده متصل شوند و به این ترتیب سیگنال را تقویت کنند.

معایب روش الایزای غیرمستقیم

واکنش متقابل ممکن است با فعالیت آنتی بادی ثانویه رخ دهد و منجر به ایجاد سیگنال غیراختصاصی شود. در این روش یک مرحله انکوباسیون اضافی برای شناسایی نهایی انجام می‌شود.

الایزا ساندویچ (Sandwich ELISA)

آنتی ژن‌ها را می‌توان توسط الایزا به روش ساندویچ شناسایی کرد. در این تکنیک، آنتی بادی‌ها بر روی سطح چاهک‌ها پوشش داده ‌می‌شوند. سپس نمونه‌ای حاوی آنتی ژن به چاهک‌ها اضافه شده و بعد از آن، برای انجام واکنش بین آنتی ژن و آنتی بادی و ایجاد کمپلکس آنتی ژن – آنتی بادی به پلیت واکنش زمان داده می‌شود. پس از انجام مراحل شستشو، آنتی بادی ثانویه متصل به آنزیم به واکنش اضافه شده و اجازه داده می‌شود تا این آنتی بادی به آنتی ژن (از طریق اپی‌توپ epitope یا سایت اتصال دیگر آنتی ژن متصل می‌شود) اتصال یابد. پس از این مرحله، آنتی بادی‌های آزاد با شستشو حذف می‌شوند و در نهایت سوبسترا اضافه می‌شود که توسط آنزیم هیدرولیز شده و محصولات رنگی تولید می‌کند. این روش اختصاصیت بالایی دارد، زیرا به یک جفت آنتی بادی برای جذب و تشخیص نیاز دارند. همچنین در این نوع  الایزا نیاز به تخلیص و آماده‌سازی نمونه پیش از انجام آزمون نیست.

الایزا به روش ساندویچ
تصویر ۵: روش الایزا ساندویچ برای شناسایی آنتی ژن

مزایای روش الایزای ساندویچ

این روش دارای اختصاصیت بالایی است ، به طوری که آنتی ‌ژن و آنتی‌ بادی به شکل کاملا اختصاصی به یکدیگر متصل می‌شوند.

این روش مناسب برای نمونه‌های پیچیده است و آنتی‌ ژن قبل از شروع آزمون نیازی به تغییرات و تخلیص ندارد. این روش مانند روش الایزای مستقیم و غیرمستقیم انعطاف پذیری و حساسیت بالایی دارد.

الایزا رقابتی (Competitive ELISA)

این آزمون رقابتی برای اندازه‌گیری غلظت آنتی ژن در یک نمونه استفاده می‌شود. در تکنیک رقابتی، رقابت برای اتصال به آنتی بادی بین دو آنتی ژن انجام می‌شود. آنتی بادی ابتدا در محلول همراه با یک نمونه حاوی آنتی ژن ناشناخته قرار می‌گیرد. سپس مخلوط آنتی ژن و آنتی بادی به چاهک پوشیده شده با آنتی ژن شناخته ‌شده اضافه می‌شوند. آنتی بادی‌های آزاد در نمونه، با آنتی ژن متصل به سطح واکنش می‌دهند. پس از شستشوی و حذف آنتی بادی‌های اتصال ‌نیافته با آنتی ژن سطح، آنتی بادی ثانویه نشان‌دار شده با آنزیم که برای اتصال به آنتی بادی اولیه اختصاصی عمل می‌کند، جهت تعیین مقدار آنتی بادی اولیه متصل به چاهک به محیط واکنش اضافه می‌شود. پس از این مرحله، یک سوبسترا برای ایجاد سیگنال رنگی به محلول افزوده می‌شود.

غلظت رنگ به طور معکوس متناسب با مقدار آنتی ژن موجود در نمونه است. این نوع واکنش یکی از چند روش ممکن برای شناسایی آنتی ژن‌هایی با وزن مولکولی کم با تعداد محدودی سایت‌های اتصال (اپی‌توپ) به آنتی بادی به شمار می‌آید. روش رقابتی، خود به دو روش رقابتی يا مهاری برای آنتی ژن و روش رقابتی برای آنتی بادی تقسیم می‌شود. اساس روش مهاری برای آنتی ژن، بررسی رقابت بين آنتی ژن نشان‌دار شده و آنتی ژن موجود در نمونه برای اتصال به يک آنتی بادی اختصاصی (که به صورت کوت شده در چاهک‌ها قرار گرفته) است. از طرف دیگر، در روش رقابتی برای آنتی بادی، رقابت بين دو آنتی بادی است که یکی از آن‌ها در نمونه قرار گرفته و بدون آنزیم نشان‌دار است و دیگری آنتی بادی نشان‌دار شده با آنزیم است که برای اتصال به يک آنتی ژن اتصال یافته به سطح چاهک‌ها با هم به رقابت می‌پردازند.

الایزای رقابتی
تصویر ۶: شناسایی آنتی ژن ناشناخته به روش رقابتی توسط آنتی ژن شناخته ‌شده یا رفرنس

کاربرد ELISA

  • با استفاده از آزمون‌های الایزا وجود آنتی ژن یا حضور آنتی بادی در نمونه می‌تواند مورد بررسی قرار گیرد.
  • تعیین غلظت آنتی بادی سرم در یک آزمایش ویروسی با روش الایزا قابل انجام است.
  • شناسایی آلرژن‌های و پاتوژن‌ها در صنایع غذایی با الایزا انجام می‌شود.
  • در آزمایشگاه‌های پزشکی، ردیابی گسترش بیماری‌ها مانندHIV، آنفولانزا، سرماخوردگی، وبا،  STD و غیره با روش الایزای صورت می‌گیرد.
کیت الایزا تشخیص ایدز
تصویر ۷: کیت‌های الایزا تشخیص بیماری ایدز

تفسیر داده‌‌های ELISA

روش ELISA سه نوع مختلف از داده‌‌های خروجی را ارائه می‌دهد:

  • روش کمی: داده‌‌های ELISA را می‌توان در مقایسه با یک منحنی استاندارد (رقیق سازی سریالی یک آنتی ژن شناخته شده و خالص) تفسیر کرد تا به طور دقیق غلظت آنتی ژن در نمونه‌‌های مختلف محاسبه شود.
  • روش کیفی: از ELISA نیز می‌توان برای دستیابی به پاسخ به اصطلاح بله یا خیر یا کیفی استفاده کرد که نشان می‌دهد یک آنتی ژن خاص در یک نمونه وجود دارد یا خیر، این بررسی در مقایسه با یک چاهک خالی که فاقد آنتی ژن یا حاوی یک آنتی ژن کنترل است، انجام می‌شود.
  • روش نیمه کمی: از آزمون‌های الایزا برای مقایسه سطح نسبی آنتی ژن در نمونه‌‌های آزمایش استفاده می‌شود، زیرا شدت سیگنال با غلظت آنتی ژن به طور مستقیم تغییر خواهد کرد.

داده‌‌های ELISA به طور معمول به صورت نمودارهایی از چگالی نوری (یا فلورسانس) در مقابل غلظت تهیه شده تا یک منحنی سیگموئیدی تولید شود، در شکل زیر نمونه‌ای از نتایج آزمون الایزا  مشاهده می‌شود. غلظت آنتی ژن شناخته شده برای تولید یک منحنی استاندارد به کار می‌رود و سپس از این داده‌‌ها برای اندازه‌گیری غلظت نمونه‌‌های ناشناخته با مقایسه با بخش خطی منحنی استاندارد استفاده می‌شود. در واقع، این منطقه خطی، بخشی نسبتاً طولانی از منحنی است که باعث می‌شود نتایج آزمون الایزا دقیق و قابل تکرار باشد. غلظت آنتی ژن ناشناخته را می‌توان به طور مستقیم بر روی نمودار یا با نرم افزار اتصالی منحنی تعیین کرد که به طور معمول در پلیت‌های خوانش الایزا یافت می‌شود.

نمودار داده های الایزا
تصویر ۸: مثالی از نمودار داده‌های الایزا

منابع: mybiosource، Enzyme Linked Immunosorbent Assay،immunology

بستن منو
×

سبد خرید