واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) یک ابزار مولکولی کارآمد و مقرون به صرفه برای تکثیر نسخههای رشتههای کوتاه DNA یا RNA است. PCR اولین بار در سال 1983 توسط بیوشیمیست آمریکایی و برنده جایزه نوبل «کری مولیس» (Kary Mullis) به دنیا معرفی شد.
PCR اصول هیبریداسیون یا جفت شدن رشتههای اسید نوکلئیک را با روش همانندسازی آنها ترکیب میکند که این اصول طی چرخههای مکرری در غالب واکنشهای رنجیرهای ترکیبی اسید نوکلئیک، منجر به تکثیر توالی کوتاهی از اسید نوکلئیک میشود. در این فرایند توالیهای DNA / RNA هدف به صورت تصاعدی در طول یک مدت نه چندان زیاد تکثیر میشوند.
اصول انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR)
این روش تکثیر آزمایشگاهی میتواند با استفاده از دو الیگونوکلئوتید سنتز شده به نام پرایمر یا آغازگر (Primer) که به دنباله ژنومی هدف وصل میشوند، انجام شود؛ به طوری که این پرایمرها یک نسخه تک رشته از رشته اسید نوکلئیک هدف را مورد شناسایی قرار داده و تکثیر میکنند. در انواع مختلف واکنشهای زنجیره پلیمراز (PCR) رشتههای اسید نوکلئیک توسط یک آنزیم پلیمرازی به نام Taq پلیمراز (یک DNA پلیمراز مقاوم دما استخراج شده از باکتریهای ترموفیلوس) تکثیر میشوند.
واکنشهای PCR در دستگاههای ترموسایکلر انجام میگیرند. در این دستگاه در یک فرآیند خودکار چرخههای مکرری (معمولاً 25 تا 40 چرخه) از مراحل واکنشهای پلیمریزاسیون انجام میگیرد که این مراحل شامل موارد زیر است:
1- دناتوراسیون DNA از الگوی و ایجاد اسید نوکلئیک تک رشته (در دمای 9۳ تا ۹۵ درجه سانتیگراد)
2- شناسایی رشته هدف و اتصال به توالیهای مکمل درآنها توسط پرایمرها (در۵۲ تا ۵۶ درجه سانتیگراد)
3- تکثیر توالیهای اسید نوکلئیکی به وسیله اتصال آنزیم Taq پلیمراز به دو رشته تشکیل شده DNA هدف و پرایمر آن (در ۷۰ تا ۷۵ درجه سانتیگراد)
در ادامه به معرفی مختصری از دو عناصر اصلی مورد نیاز برای انجام تمام انواع واکنشهای PCR میپردازیم:
پرایمر
پرایمرها یا توالیهای آغازگر یک بخش کوتاه از توالی نوکلئوتیدی هستند که به صورت مکمل با بخشی از DNA یا RNA هدف که قرار است تکثیر شود، ساخته میشود. این دو توالی DNA کوتاه، برای اتصال به شروع (آغازگر رو به جلو) و پایان (آغازگر معکوس) توالی هدف در واکنش های PCR طراحی شده و مورد استفاده قرار میگیرند و به این ترتیب ابتدا و انتها و یا در حالت کلی طولی رشتهای که قرار است تکثیر شود، توسط پرایمرها تعیین میشود.
آنزیم Taq پلیمراز
این آنزیم یک DNA پلیمراز است که از نظر حرارتی میتواند پایدار باشد. آنزیم Taq پلیمراز اولین بار از باکتریهای ترموفیلیک یا گرما دوست «Thermus aquaticus» جدا شد. به دلیل شرایط دمایی که بر چرخههای PCR حاکم است تنها این آنزیمها میتوانند در برابر دما بالا مقاومت کرده و فعالیت خود را از دست ندهد.
اجزای اصلی برای انجام انواع واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR)
1- الگوی DNA:DNA نمونهای که حاوی توالی هدف برای تکثیر است.
2- تری فسفاتهای دیئوکسی ریبونوکلئوزید (dNTPs)
3- بافر PCR
4- آغازگرها (رو به جلو و معکوس)
5- Taq پلیمراز
واکنشهای زنجیرهای پلیمراز PCR
برای انجام PCR، نمونه استخراج شده (که شامل الگوی DNA هدف است) به یک لوله حاوی آغازگرها، نوکلئوتیدهای آزاد (dNTPs) و Taq پلیمراز اضافه میشود. مخلوط واکنش PCR در دستگاه ترموسایکلر قرار میگیرد. دستگاه ترموسایکلر در طی مراحل اتوماتیک و برنامه ریزی شده، دمای مخلوط PCR را افزایش و کاهش میدهد که در نهایت به صورت تصاعدی نسخههای توالیهای هدف را تکثیر میکند.
واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) سه مرحله اساسی دارد که به طور کلی با اندکی تغییر در تمام انواع روشهای PCR انجام میشود.
مراحل واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)
دناتوراسیون (جداسازی رشته): در اولین مرحله دو زنجیره مکمل DNA متصل به یکدیگر (از طریق پیوندهای هیدروژنی بین بازها) در طی یک فرآیند گرمایش (9۳ تا 9۵ درجه سانتیگراد) جدا میشوند و توالی تک رشتهای هدف ایجاد میشود.
اتصال (اتصال آغازگر): در این مرحله درجه حرارت واکنش کاهش مییابد (45 تا60 درجه سانتیگراد) بنابراین آغازگرها میتوانند رشته های DNA تک رشته هدف را شناسایی و به آن متصل شوند.
گسترش یا تکثیر (سنتز DNA جدید): این مرحله از لحظه اتصال پرایمرها به رشته هدف شروع میشود. با اتصال آنزیم به دو رشته پرایمر و رشته هدف، تکثیر DNA انجام میگیرد. فعالیت آنزیم در دمای ۷۲ درجه اتفاق میافتد.
پس از اتمام چرخه اول، این روند با بازگشت دما دستگاه به اولین مرحله ادامه پیدا میکند. این چرخهها در هر واکنش PCR در حدود ۱ تا ۴ ساعت ادامه مییابد و نتیجه آن تولید تعداد زیادی از نسخهها از رشته DNA هدف است
شناسایی محصولات PCR
پروب نشاندار شدهای (مولکول گزارشگر) که برای توالی ژن هدف به صورت اختصاصی طراحی شده است، برای تشخیص محصول رشته DNA تکثیر شده با تکنیک PCR (این رشتههای تکثیر شده به نام آمپلیکون شناخته میشوند) مورد استفاده قرار میگیرد. براساس ماهیت مولکول گزارشگر مورد استفاده، این پروب ممکن است انواعی از سیگنالهای رادیواکتیو، رنگی، فلورومتری یا شیمیایی را تولید کند. پروبها نشان دار شده برای تشخیص آمپلیکونها دو هدف را دنبال میکنند:
1- امکان مشاهده محصولات PCR را فراهم میکنند.
2- به دلیل این که این پروبها طوری طراحی میشوند که تنها به رشته DNA مورد نظر متصل میشوند، بنابراین نتایج حاصل از تکثیر رشته هدف را به نمایش می گذارند و به رشتههای DNA دیگر متصل نمیشوند.
جدا از روش هیبریداسیون مبتنی بر DNA ، گاهی اوقات روش الکتروفورز ژل ساده برای تأیید وجود محصولات PCR نیز )رشتههای هدف تکثیر شده) کافی است.
انواع واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR)
تغییرات متعددی در روش متداول PCR برای افزایش استفاده از آن در روشهای تشخیصی پزشکی و سایر کاربردهای ژنتیکی ایجاد شده است. در این مطلب انواع تکنیکهای مشتق شده از تکنیک PCR را نام برده و به معرفی برخی از انواع پرکاربرد آنها میپردازیم:
1- Real-Time PCR یا PCR quantitative (PCR کمی)
2- PCR معکوس یا Reverse-Transcriptase PCR (RT-PCR)
3- Multiplex PCR یا PCR چندگانه
4- PCR تودر تو یا Nested PCR
5- High Fidelity PCR
6- سریع PCRیا Fast PCR
7- Hot start PCR
8- GC-Rich PCR
9- دوربرد PCR
10- PCR دیجیتال
کاربردهای مختلف انواع تکنیکهای PCR
هر کدام از تکنیکهای PCR که در بالا معرفی شد، در زمینههای مختلف پزشکی و زیست شناسی کاربردهای متعددی دارند. در زیر به برخی از این کاربردها اشاره میشود:
1- شناسایی و شناخت ویژگیهای عوامل عفونی یا پاتوژنها
2- تشخیص مستقیم میکروارگانیسمها در نمونههای بیماران
3- شناسایی میکروارگانیسمهای رشد یافته در محیط کشت
4- تشخیص مقاومت ضد میکروبی
5- بررسی ارتباطهای بین پاتوژنهای مختلف
6- انگشت نگاری ژنتیکی (Genetic fingerprinting) ؛ از این روش در آزمایشات پزشکی قانونی و آزمایشهای تعیین 7- 7- والدین استفاده میشود. تشخیص جهش (بررسی بیماریهای ژنتیکی)
8- شناسایی جهشهای ژنتیکی ( تشخیص بیماریهای ژنتیکی)
9- کلونینگ ژن
10- تعیین توالی به وسیله PCR
در این جا برخی از روشهای متداول PCR به طور مختصر مورد بررسی قرار می دهیم:
Real-Time PCR
این نوع از PCR به عنوان PCR زمان واقعی و همچنین «PCR کمی» شناخته میشود. Real-Time PCR نوعی از واکنش زنجیرهای پلیمراز استاندارد است که در آن تکثیر و اندازهگیری میزان DNA هدف به طور همزمان توسط دستگاه Real-Time PCR با استفاده از ترموسیکلرهای تشخیص دهنده فلورسانس انجام میشود. رنگهای فلورسنت به طور خاص به DNA مورد نظر متصل میشوند و همزمان با طی روند چرخههای PCR به دلیل اتصال به پروبهای فلورسانس شناسایی میشوند. در واقع میزان فلورسانس تولید شده متناسب با مقدار DNA تولید شده در واکنش PCR است.
اگرچه مدلهای مختلفی از دستگاه و روشهای Real-Time PCR در آزمایشگاهها موجود است اما همه آنها ویژگیهای مشترکی دارند:
همه این دستگاهها یک بستر استاندارد از چرخههای دمایی دارند که در کنار آن یک منبع نوری برای تحریک وجود دارد (معمولاً یک لامپ لیزری یا تنگستن). علاوه بر این، یک دوربین برای تشخیص پرتوهای فلورسانس و رایانه و نرم افزار برای پردازش دادههای حاصل از انجام چرخههای PCR در این دستگاهها وجود دارد.
بسته به نوع منبع تحریک موجود و فیلترهای تشخیصی، ممکن است در Real-Time PCR از انواع متفاوتی از رنگهای فلورسنت استفاده شود. دو گونه از رنگهای فلورسانسی که به طور متداول در Real-Time PCR مورد استفاده قرار میگیرند، شامل موارد زیر هستند:
سایبر گرین یا (SYBR green) : این ترکیب، رنگ فلورسانسی است که به DNA دو رشته متصل میشود، اما قادر به اتصال به DNA تک رشتهای نیست. زمانی که سایبر گرین به DNA دو رشتهای متصل میشود از خود فلورسانس منتشر میکند که توسط حسگرهای دستگاه Real-Time PCR قابل شناسایی است.
پروب TaqMan: این پروب از انواع پروبهای هیدرولیزی است. در دو انتهای خود دارای دو مولکول فلورفور و خاموش کننده است و در صورت اتصال به DNA دو رشتهای میتواند از خود فلورسانس نشر دهد که با حسگرهای دستگاه قابل تشخیص هستند.
PCR معکوس (RT-PCR)
این تکنیک از PCR برای تکثیر رشتههای RNA هدف به کار میرود. در روش RT-PCR به جای آنزیم Taq پلیمراز از آنزیم رونوشت بردار RNA یعنی آنزیم رونوشت بردار معکوس یا Reverse Transcriptase استفاده میشود.
آنزیم رونوشت بردار معکوس میتواند RNA را به عنوان الگو قرار داده و از روی آن cDNA بسازد. cDNA تک رشتهای با استفاده از DNA پلیمراز به DNA دورشته تبدیل میشود. این مولکولهای DNA اکنون میتوانند به عنوان الگوهای واکنش PCR استفاده شوند.
آنزیمهای رونوشت بردار معکوس از خانوادهای از ویروسها به نام رتروویروس استخراج میشوند. رتروویروسها دارای ژنومی از جنس RNA هستند؛ به همین دلیل از آنزیم رونوشت بردار معکوس برای همانندسازی و تکثیر ژنوم خود استفاده میکنند.
تکنیک RT-PCR در بسیاری از تحقیقات پزشکی برای شناسایی ویروسهایی با ژنوم RNA، تشخیص rRNA میکروارگانیسمهای مختلف و سنجش بیان ژن به کار گرفته میشود.
PCR چندگانه
Multiplex PCR نوعی از تکنیک PCR است که در آن بیش از یک توالی هدف با استفاده از چندین مجموعه از پرایمرها در مخلوط واکنش PCR تکثیر میشوند. PCR چندگانه امکان تکثیر چندین بخش از یک ژن را به صورت همزمان فراهم میکند. این فناوری برای اولین بار توسط «چمبرلین» (Chamberlain) و همکارانش در سال ۱۹۸۸ برای تشخیص بیماری «دیستروفی عضلانی دوشن» مورد استفاده قرار گرفت.
تکنیک PCR چندگانه یک روش، سریع و مقرون به صرفه برای آنالیزهای ژنتیکی است که باید بارها و بارها تکرار شوند (به عنوان مثال در توالی یابی DNA). این روش به مقدار کمی از DNA (در حدود 10-200 نانوگرم) به عنوان الگوی شروع نیاز دارد و میتواند بر روی نمونههایی با کیفیت DNA زیر حد متوسط انجام گیرد. اگرچه تکنیک Multiplex PCR فواید زیادی دارد، بهینه سازی آن به همان اندازه چالش برانگیز است. از آن جایی که در این روش از چندین پرایمر برای اهداف مختلف استفاده میشود، ممکن است این پرایمرها با هم تعامل داشته و به یکدیگر متصل شوند. همان طور که میدانید هر جفت پرایمر میتواند الزامات مختلفی داشته باشد، بنابراین یک دمای ذوب مطلوب (Tm) و ΔG (انرژی آزاد) واحد برای همه جفتهای پرایمر وجود ندارد.
Nested PCR یا تو در تو
تکنیک Nested PCR برای اصلاح روش PCR متداول ایجاد شده است؛ به طوری که در این تکنیک دقت، حساسیت و اختصاصیت واکنش افزایش مییابد. تکنیک Nested PCR شامل استفاده از دو مجموعه پرایمر است که برای یک رشته هدف واحد طراحی شدهاند و دو واکنش PCR پی در پی، رشته هدف را تکثیر میکنند.
مجموعه اول پرایمرها برای ردیابی توالیهای بالادست رشته هدف و مجموعه پرایمرهای دوم برای شناسایی توالیهای پایین دست رشته هدف سنتز شدهاند. در این حالت مجموعه دوم پرایمرها نسبت به مجموعه اول داخلی هستند؛ به همین دلیل است که به این تکنیکNested یا PCR تو در تو میگویند. مجموعه اول پرایمرها را «پرایمرهای خارجی» نیز مینامند. پرایمرهای خارجی بخشهای بزرگی از ژن مورد نظر را تکثیر میکنند. بخشهای کوچکی از ژنهای تکثیر شده در دور اول با پرایمرهای خارجی، به عنوان الگو برای دور دوم PCR با ستفاده از پرایمرهای مجموعه دوم یا پرایمرهای داخلی (پرایمرهای تو در تو) مورد استفاده قرار میگیرند.
PCR تو در تو و پرایمرهای داخلی و خارجی آن
رویکرد قدیمی PCR تو در تو، این بود که تعدادی چرخه PCR با استفاده از اولین مجموعه پرایمرها انجام گیرد و سپس درب تیوپهای واکنش باز شده و مجموعه پرایمرهای دوم برای انجام چرخههای بعدی PCR به مخلوط واکنش اضافه شود. مشکل اصلی این روش، آلودگی آمپلیکونها یا محصولات PCR در آزمایشگاه و به تبع آن از بین رفتن حساسیت و اختصاصیت آزمون PCR بود. برای حل این مشکل در Nested PCR روش واکنشهای PCR تک لولهای (Single-Tube Nested PCR (STNPCR) Reactions) توسعه داد شد که در آن هر دو مجموعه پرایمرها به لوله واکنش اولیه اضافه میشوند و PCR گستردهای انجام میگیرد.
آمپلیکون های این روش PCR با استفاده از الکتروفورز کردن مخلوط واکنش در ژل آگارز آغشته به اتیدیم برمید 2٪ همراه با یک نشانگر وزن مولکولی قابل مشاهده هستند.